【技术解析】非标记法靶标筛选——DARTS-MS/CETSA-MS/LiP-MS 技术原理、适用场景一文理清

DARTS-MS、CETSA-MS、LiP-MS这三种技术都是当前化学生物学和药物研发中非常核心的药物靶点鉴定的非标记Label-free质谱技术。它们的核心原理都是利用小分子结合靶蛋白后改变了靶蛋白的物理或化学稳定性。一、DARTS-MS (药物亲和力响应靶向稳定性技术)DARTS-MS的核心原理是小分子与靶蛋白结合后会改变蛋白质的构象从而使其对蛋白酶如 Pronase的降解产生抗性变得更难被降解。DARTS 的关键在于控制好蛋白酶的消化比例和时间。DARTS-MS的实验步骤一般包括1、细胞裂解与蛋白提取在非变性、不含蛋白酶抑制剂的裂解液中裂解细胞通常使用 M-PER 或类似温和去污剂获取总蛋白。2、小分子孵育将裂解液分为两组分别加入小分子药物实验组和溶剂对照/Vehicle对照组在室温或 4℃下孵育一段时间使药物与靶蛋白充分结合。3、限制性酶解Pronase消化加入低浓度的广谱蛋白酶如 Pronase。由于小分子结合保护了靶蛋白靶蛋白降解速度变慢。需要设置一系列蛋白酶浓度梯度或时间梯度。4、终止反应加入 SDS-PAGE 上样缓冲液并立即加热煮沸或者加入蛋白酶抑制剂混合物终止消化。5、质谱分析或Western Blot若用 Western Blot跑胶后检测特定候选蛋白的条带丰度。若用 质谱MS进行胶内酶解或溶液内酶解通过高分辨质谱如标价定量/Label-free, TMT标记检测哪些蛋白在药物存在下稳定性增加了未被降解或者降解速度变慢。适用场景1、天然产物、小分子表型筛选后的靶点初步快速鉴定。2、细胞裂解液层面的体外in vitro靶点结合验证。经典案例雷帕霉素Rapamycin的靶点验证在 DARTS 技术发展初期研究者用该技术成功验证了雷帕霉素与 FKBP12 蛋白的结合。将细胞裂解液与雷帕霉素孵育后进行 Pronase 酶解。质谱和 WB 结果显示在对照组中 FKBP12 很快被降解消失而在雷帕霉素存在组中FKBP12 条带保持完好。这证明了 DARTS 在不需要任何化学标记的情况下就能直接鉴定小分子与高亲和力靶蛋白的互作。适配的靶标类型1、可溶性蛋白质细胞质、细胞核蛋白。2、对因小分子结合而产生显著构象变化的蛋白质效果最好。优点1、简便快速不需要复杂的仪器主要步骤就是孵育和酶切。2、无需标记药物和小分子都不需要进行化学修饰。3、背景干扰相对较小基于最基础的物理阻碍原理。缺点1、不适用于活细胞通常只能在细胞裂解液中进行。2、假阳性/假阴性高酶切条件时间和浓度非常敏感难以精确控制如果靶蛋白本身对蛋白酶高度耐受则无法检测。3、不适合膜蛋白去污剂会干扰酶切反应。二、CETSA-MS (细胞热转变分析-质谱联用)CETSA-MS的核心原理是基于热变性原理。小分子与靶蛋白结合后通常会提高蛋白质的热稳定性使其在高温下不易变性沉淀。通过离心去除变性沉淀用质谱定量上清液中残留的互作蛋白。CETSA 的核心是利用“热变性”差异质谱联用时通常采用 ITDR等温剂量反应 或 Melt Curve熔解曲线 两种模式。CETSA-MS的实验步骤一般包括1、小分子处理活细胞模式In cell直接将小分子药物加入活细胞培养基中孵育。裂解液模式In lysate将细胞裂解后在体外与小分子孵育。2、热冲击处理Heating将样品平分到不同的 PCR 管中。Melt Curve 模式分别在不同的温度如40℃至70℃通常设置10个温度点下加热数分钟。ITDR 模式在固定温度下处理不同药物浓度梯度的样品。3、离心分离Separation加热后立即降温并在高转速下离心。变性沉淀的蛋白会沉到管底而未变性被药物稳定住的靶蛋白留在上清液中。4、上清液提取与消化收集上清液利用 Trypsin胰蛋白酶将上清中的蛋白质完全消化成肽段。5、质谱定量MS通常结合 TMT同位素标签变性标记 技术将不同温度或不同浓度点的样品合并一管进行定量质谱分析绘制出蛋白质的熔解曲线Melting Curve。适用场景1、活细胞in situ或组织内的靶点验证与筛选最接近生理真实状态。2、药物在体内分布、靶点占有率Target Engagement的定量评估。经典案例抗癌药物 methotrexate (MTX氨甲蝶呤) 的靶点网络动态研究MTX 是广为人知的二氢叶酸还原酶DHFR抑制剂。研究人员将活的癌细胞暴露于 MTX 中利用 CETSA-MS 技术进行全蛋白组热稳定性分析。结果不仅观察到主靶点 DHFR 的热变性温度Tm发生了极显著的右移即被大幅度稳定同时也鉴定到了下游信号通路中一些协同变化的“脱靶Off-target”蛋白或复合物组分。这为评估药物在活细胞内的靶点占有率和选择性提供了直接证据。适配的靶标类型1、外周膜蛋白、胞质蛋白、胞核蛋白。2、通过改进如微粒体CETSA也可以用于部分膜蛋白和多蛋白复合物。优点1、可在活细胞/体内进行能反映药物穿透细胞膜的能力以及细胞内真实环境的竞争结合。2、技术非常成熟是目前工业界和学术界认可度极高的靶点验证金标准之一。缺点1、样品消耗量大、成本高需要设置一系列温度梯度每个温度都要跑质谱。2、存在局限性约有20-30%的蛋白质在受热时行为异常不沉淀或受其他蛋白协同沉淀影响导致无法分析。三、LiP-MS (限速酶解-质谱联用)LiP-MS的核心原理是在非变性条件下对蛋白质进行短时间的限制性内切酶如蛋白酶K降解。小分子结合会掩盖切位点或改变构象导致该特定区域的酶切片段发生变化。随后将蛋白完全变性并用Trypsin切成肽段进行质谱分析。LiP 的核心在于利用非特异性酶进行“表面结构探测”再用特异性酶进行“序列切断”。LiP-MS的实验步骤一般包括1、细胞裂解与药物孵育在维持蛋白质天然三维构象的缓冲液中裂解细胞加入小分子药物或对照孵育使其结合。2、限制性内切酶降解LiP 消化加入极少量的蛋白酶KProteinase K在室温或低温下进行极短时间如 1–5 分钟的反应。蛋白酶K只会切割暴露在蛋白质表面、未被药物掩盖或因构象改变而暴露的特定位点。3、完全变性与终止加入强变性剂如高浓度尿素或加热使蛋白酶K失活并让所有蛋白质彻底伸展。4、完全酶解Trypsin 消化加入常规的胰蛋白酶Trypsin在变性条件下将所有蛋白质完全消化成标准质谱肽段。5、数据依赖/非依赖型质谱分析DDA/DIA-MS由于蛋白酶K切断了部分位点导致最后产生的 Trypsin 肽段中有一些原本应该完整的肽段“变短”或消失了被称为 LiP 肽段。通过高精度质谱如 DIA 模式定量比对找出这些由于药物结合而受到保护或发生改变的特定肽段。经典案例代谢物-蛋白质互作网络Metabolite-Protein Interactions的大规模筛选。细胞内的天然代谢产物如 ATP、脂肪酸、氨基酸通常具有多靶点、弱亲和力的特点很难用传统方法捕捉。苏黎世联邦理工学院ETH的 Picotti 团队利用 LiP-MS 技术在酿酒酵母细胞裂解液中直接添加不同浓度的代谢物如高浓度的20种氨基酸。通过 LiP-MS他们不仅在全蛋白组水平上绘制出了上千种代谢物-蛋白质的互作网络而且精准定位到了代谢物结合在酶的变构调节位点Allosteric site上的具体肽段序列。这证明了 LiP-MS 在寻找未知小分子构象变化位点上的独特优势。适用场景1、全蛋白质组级别的靶点高通量筛选能够同时鉴定成千上万个蛋白。2、结合位点Binding Site的精确图谱绘制不仅知道哪个是靶点还能定位到哪个结构域结合。适配的靶标类型非常广泛包括可溶性蛋白、复合体甚至包括部分复杂的膜蛋白。优点1、分辨率极高可以精确到氨基酸序列/肽段水平的结构变化。2、通量高且信息量大一次实验既筛选了靶点又拿到了位点信息。3、可在接近生理浓度的复杂裂解液中进行。缺点1、数据分析极度复杂需要极其高精度和高速度的质谱如DIA模式以及强大的生物信息学算力支持。2、通常也在裂解液中进行虽然有活细胞LiP的尝试但技术难度极高。DARTS-MS / CETSA-MS / LiP-MS 技术综合对比表